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发布时间:2022-09-07 00:41:31 | 浏览:
一、 复苏 1. 2. 把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动。液体都融化后(大概 把上述细胞悬液吸到装10ml 培养基的15ml 的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍, 1-1.5分钟) ,拿出来喷点酒精放到超净工作台里。 把粘在壁上的细胞都洗下来) ,1000转离心5分钟。 3. 把上清液倒掉,加1ml 培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml 培养基的10cm 培养皿中 前后左右轻轻摇动,使培养皿中的细胞均匀分布。 4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等,放到 CO2培养箱中培养,细胞贴壁后换培养基。 5. 3天换一次培养基。 二、 传代 1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。 2. 4. 把原有培养基吸掉。 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。 3. 加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行) ,消化1-2分钟。 5. 用移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。 6. 把细胞吸到15ml 的离心管中,1000转离心5分钟。 7. 8. 倒掉上清液,加1-2ml 培养基,把细胞都吹起来。 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般,癌细胞分5个,正常细胞传3个。继续
培养。 三、 冻存 把细胞消化下来并离心(同上) 。用配好的冻存液把细胞悬浮起来,分装到灭菌的冻存管中, 静止几分钟,写明细胞种类,冻存日期。4℃ 30min,-20℃ 30min,-80℃过夜,然后放到 液氮灌中保存。 冻存液的配制: 70%的完全培养基20%FBS10%DMSO. DMSO 要慢慢滴加,边滴边摇。 要注意的就是无菌操作!
PCR 技术操作程序和优化方法 典型的 PCR 操作 (一) 试剂 (1)引物根据待扩增 DNA 不同,引物亦不同。 (2)耐热 DNA 聚合酶:此酶是从耐热细菌中分离出来的,能耐受高温(93—100℃)。 (3)10x PCR 缓冲液: 500mm01/L KCl; 100mmol/L Tris 一 HCl(pH8.4, 20℃), 150mmol /L MgCl2, lmg/m1 明胶。 (4)5mmo1/L dNTP 贮备液:将 dATP,dCTP,dGTPT 和 dTTP 钠盐各 100mg 合并,加 3m1 灭菌去离子水溶解,用 NaoH 调 pH 至中性,分装每份 300v1, (-) 20℃保存 dNTP 浓度最好用 uv 吸收法精确测定。另外。现在已有中性 dNTP 溶液商品供应(Sigma 公司和 Pharmacia 公司等). (5)标本处理试剂:不同标本所需试剂不同,根据具体情况而定. (二) 操作程序 利用 PcR 扩增的操作程序基本相同,只是根据引物与靶序列的不同,选择不同的反应体系与 循环参数(见本章第::节)o 基本的操作是将 PcR 必需反应成分加入一微量离心管中,然后置于一 定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯,但需遵守一定的操 作规范。 我们推荐下述操作程序,因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。 (1)向一微量离心管中依次加入: ddH20 dNTP 引物 补至终体积(终体积 50~100ul) 1/10 体积 各 200umol/L 各 1umol/L 10*10 一 10*10*10*10*10 拷贝 10 x PCR 缓冲液
混匀后,离心 15s 使反应成分集于管底。 (2)加石蜡油 50—100ul 于反应液表面以防蒸发。 置反应管于 97c 变性 7min(染色体 DNA)或 5min(质 粒 DNA). (3)冷至延伸温度时,加入 1—5U Taq DNA 聚合酶,在此温度作用 1min. (4)于变性温度下使模板 DNA 变性适当时间。 (5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。 (6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。 (7)重复(4)一(6)步 25—30 次。每次即为一个 PcR 循环 o (8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第 7 节)o 上述过程可以用 PcR 自动热循环仪进行,也可以设定 3 个恒温水浴锅手工操作.
第二节 PCR 条件的优化 PCR 必需具备下述基本条件:①模板核酸(DNA 或 RNA);②人工会成的寡核苷酸引物;②合适 的缓冲体系;①Mg2;⑤三磷酸脱氧核苷酸;⑥耐热 DNA 聚合酶;⑦温度循环参数(变性、复性 和延伸的温度与时间以及循环数)o 另外,还有一些其它因素,如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶
或小牛血清白蛋白等也影响某些特定 PCR。 下面分别讨论这些因素在 PCR 反应中的作用及其对 PCR 的影响。 一、模扳核酸 PcR 可以以 DNA 或 RNA 为模板进行核酸的体外扩增。不过 RNA 的扩增需首先逆转录成 cDNA 后才能进行正常 PCR 循环。核酸标本来源广 6t 可以从纯培养的细胞或微生物中提取,也可以从临 床标本(血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等)、罪现场标本(血班、毛发、精斑等)和病理解剖标 本(新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织)以及考古标本中直接提取。无论标本来源如何,待扩增核酸 都需部分纯化使核酸标本中不合 DNA 聚合酶抑制剂。 PcR 反应中模板加入量一般为 10*10 一 l0*10*10*10*10 拷贝的靶序列。1ug 人基因组 DNA 相当于 3xl0*10*10*10*10 个单拷贝的靶分子; 10ng 酵母 DNA 相当 1: 3xl0*10*10*10*10 靶分子, 1ng 大肠杆菌 DNA 相当于 3xl0*10*10*10*10 靶分子;1%的 M13 噬菌斑相当于 10*l0*10*10*10*10 靶分子。因此,扩增不同拷贝数的靶序列时,加入的合靶序列的 DNA 量亦 不同。如真核 rRNA 基因有 200—500 拷贝,反应中仅需加入 0.5—2ng 人基因组 DNA 即可。 以质粒 DNA 或染色体 DNA 为模板时的扩增最适条件是不同的。 前者所需的酶量少, 循环数夕, 温度不如染色体 DNA 要求严格。扩增染色体 DNA 时至少需 25—30 循环,如在第 15 循环后补加一 些 Taq 酶会获得更好的扩增效果。 扩增靶序列的长度根据不同目的而不同。用于检测目的的扩增片段长度一般为 500bp 以内, 以 100 一 300bp 为最好。 用 Taq DNA 聚合酶在合适条件(较长延伸时间)下, 可扩增长达 10 一 20kb 的片段。 二、引物 PCR 扩增产物的大小是山特异引物限定的。因此,引物的设计与合成对 PCR 的成功与否有着 决定性的意义。 (一) 引物合成的质量 合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。 因为合成的引物中会 有相当数量的“错误序列”,其中包括不完整的序列和脱膘吟产物以及可检测到的碱基修饰的完整链 和高分子量产物。 这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。 因此, PCR 所用引物质量要高. 且 需纯化。冻干引物干—20℃至少保存 32—24 个月,液体状于-20℃可保存 6 个月。引物不用时应存 —20℃保存。 (二) 引物的设计原则 遵循一些简单的规则有助于没计 PcR 引物,通过微机的帮助更有利于 PCR 的成功。关于引物 的详细设计原则与方法详见本章第三节。 (三) 引物的用量及其计算 一般 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2—1umol/L,在此范围内,PCR 产物量基本相同。但引 物低于 0.2umol/L 时,则产物量降低。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还 会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是 PCR 反应的底物,与靶序列竞争 DNA 聚 合酶,dNTP 底物,从而使靶序列的扩增量降低。 引物浓度的计算可按下面的方法进行:摩尔淬灭系数(Em)是 lcm 光程比色杯中测定 1mol/L 寡核苷酸溶液在 UV 260nm 下的光密度〔0D)值。Em 可按下式计算: EM=a(16000)十 b〔12000)十 c(7000)十 d(9600) 其中,a、b、c 和 d 分别代表寡核苷酸中 A、G、C 和 T 的个数。 例如, —纯化的 20mer 寡核苷酸溶于 0.1ml 水中,取 10ul 稀释至 10mL,测其 0D=0.76。 原液的 0D 为 0.76x100=76。若此寡核苷酸碱基组成为 A=5,G=5,C=5*T=5,其 EM 为: EM=5(16000)十 5(12000)十 5(7000)十 5(9600)=223000 因此,原液个寡核苷酸的摩尔浓度为:
76/223000=3.4x10-4moI/L=340nmol/L 三、缓冲液 目前最为常用的缓冲体系为 10—50mmol/L Tris—HCl(pH8.3—8.8、20c)o Tris 是一种双极性 离子缓冲液, 20℃时其 pKa 值为 8.3, pKa 值为-0.021/℃。 因此, 20mmol/L Tris 一 HCl(pH8.3, 20℃) 在实际 PCR 中,PH 变化于 6.8—7.8 之间。改变反应液的缓冲能力,如将 Tris 浓度加大到 50mmol /L, pH 8.9, 有时会增加产量。 反应混合液中 50mmol/L 以内的 KCl 有利于引物的退火, 50mm01 /L NaCl 或 50mmol/L 以上的 KCl 则抑制 Taq DNA 聚合酶的活性。有些反应液中以 NH4代 K, 其浓度为 16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白(100ug/ml 或明胶(0.01%)或 Tween20(0.05%一 0.1%)有助于酶的稳定, 反应中加入 5mmol/L 的二巯苏醇 DTT)也有类似作 用,尤其在扩增长片段(此时延仲时间长)比加入这些酶保护剂对 PCR 反应足有利的。 四、Mg2, Mg2是 TaqDNA 聚合酶活性所必需的。因此,反应中优化 Mg2浓度是非常有益的。Mg2 浓度除影响酶活性与忠实性外, 也影响着引物的退火, 模板与 PCR 产物的解链温度, 产物的特异性, 引物二聚体的形成等。Mg2浓度过低时,酶活力显著降低;过高时,则酶催化非特异的扩增。需 指出的是,PcR 混合物中的 DNA 模板、引物和 dNTP 的磷酸基因均可与 Mg2结合,降低 Mg2实 际浓度。 Taq DNA 聚合酶需要的是游离 Mg2。 因此, PCR 中 Mg2的加入量要比 dNTP 浓度高 0.2— 2.5mmol/L。最好对每种模板,每种引物均进行 Mg2浓度的优化。 另外还需注意引物和模板 DNA 原液中如含 EDTA 等螯合剂也会影响游离 Mg2浓度。 优化 Mg2浓度法:首先须知模板 DNA 量,引物和 dNTP 浓度和设定的 PcR 循环参数。反应 中的 PcR 缓冲液中不加 Mg2。Mg2是从 10mmol/LMg2贮存液中逐一加入反应管中。开始以 0.5mmol/L 递增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5—5.0mmol/L),在确定了 Mg2大概浓度以后,再在 该浓度上下,以 0.2mmol/L 递增和递减几个浓度来精确确定 Mg2的最适浓度。 五、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 贮备 dNTP 液应用 NaoH 调 pH 至中性,其浓度用分光光度计测定。贮备液为 5—10mmol/L, 分装后—20℃保存。在 PcR 的重复热循环过程热稳定性应为:50 循环后约有 50%仍为 dNTP。 反应小练种 dNTP(dATP,dGTP,dTTP 和 dCTP)的终浓度为 20-200umol/L,在此范围内,PCR 产 物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。所用的四种 dNTP 终浓度应相等,以使错误掺入率降至 最低。开始发明 PcK 时,以 K1enow 片段催化 DNA 的合成,其 dNTP 浓度要求 1.5mmol/L,而耐 热 DNA 聚合酶的应用使 dNTP 的使用浓度明显降低,这可减少在非靶位点的错误引导和降低 dNTP 的错误掺入,从而改善了 PCR 的特异性与忠实性。最低的适宜 dNTP 浓度可根据特定靶序列长度和 碱基组成来确定。如在 100ul 反应液中,每种 dNTP 若为 20umol/L,理论上足以合成 2.6ugDNA 或 10pmol 的 400bp 序列。有报道应用每种州 20umol/L 可成功地捡出 10*10*10*10*10*10*10 拷贝 DNA 分子中一个 ras 点突变。 但如此低浓度的 dNTP 在常规 PCR 中应避免。 因为保持四种 dNTP 的浓度均在按种 dNTPKm 值(10-15umol/L)以上,对保持碱基掺入忠实性是很重要的。dNTP 终浓 度大于 50mmol/L 时会抑制 TaqDNA 聚合酶活性。另外,dNTP 的类似物也可掺入 PCR 产物(参考 本章第十节)。 六、耐热 DNA 聚合酶 自从耐热 Taq DNA 聚合酶引入 PCR 后, 又有多种耐热 DNA 聚合酶(VENT 和 Tth 等)相继用 于 PcR。关于各种耐热 DNA 聚合酶的性质详见本章第四节,但目前仍以 TaqDNA 聚合酶应用较多。 不同来源聚合酶制备条件、测定方法和(或)单位定义有所不同,使用时需加以注意。下面讨论的酶 使用情况是以 PE—cetus 公司生产的 Taq 聚合酶为依据的。
而,酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化 PcR 时,最好在每 100ul 反应体积中 加入 0.5-5U 酶的范围内试验最佳酶浓度。如果酶浓度太高,则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩 增带;过低时,则靶序列产量很低。 PCR 后可通过下述方式之一灭活 Taq DNA 聚合酶: (1)99—100C 加热 10min(2)加入 EDTA Na2 至 10mmol/L 整合 Mg2;(3)酚一氯仿抽提、乙醇沉淀 PCR 产物。 七、温度循环参数 (一) 变性温度与时间 PCR 的变性一步很重要。此步若不能使靶基因模板和(或)PcR 产物完全变性,就会导致 PCR 失 败。典型的变性条件是 95℃30s,或 97℃15s,更高的温度可能更有效,尤其是对富合 G 十 C 的靶 基因。DNA 在其链分离温度(strand separation temperature 响酶活性。最简单的方法是在加 Taq 聚合酶前先使模板在 97℃变性 7—10min,在以后的循环中, 将模板 DNA 在 94℃或 95℃变性 1min, 对 PCR 的成功亦有益处。环状质粒 DNA 模板最好酶切线性化,因环状 DNA 复性极快。在扩增短片 段(100 一 300bp)时,可用简便、快速的两步 PcR 法,同时在 5—10 个循环后,将变性温度降至 87—90℃可改善 PCR 产量。具体降低程度则根据共体反应和使用的 PCR 仪而定。 (二) 复性温度与时间 如果说变性温度对 PCR 反应的成败是关键,那么复性温度则决定着 PcR 的特异性。引物复性 所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在 PcR 条 件下线℃。根据下式计算最适复性温度(Taopt)有助于 PCR 的成功。 Taopt =0.3Tm1 十 0.7Tm2-14.9 其中,Tm1 为引物的 Tm 值,Tm2 为产物的 Tm 值。 实际上, 由于模板量呈指数增加, PCR 每一个循环中的 Taopt 均不同。 因此, 采用变化的 Taopt (第一循环为 Taopt -8℃,以后每隔一循环增加 1℃),对扩增质粒模板中小于 1kb 的靶片断是有益 的 (产量增加,循环数减少),尤其对 300bp 以内片段的扩增更为有效。这种变化 Taopt 法似乎对长片 断和染色体 DNA 的扩增影响不大。但前几个循环在低 Ta 值下进行,然后再于 Taopt 下扩增,可增 加从染色体 DNA 中扩增靶序列的量。 对未知序列的扩增很难预知其 G 十 c 含量,因此,无法 计算上式中的 Tm2,不免暴露了上述估算法的缺陷。另一种更简便的方法是通过引物的有效长度 (1n)来信算。在此,还需引入另一概念,即有效启动温度(effective priming temperature,Tp)。 Tp 是最佳引物介导扩增发生时的最高温度。Tp 在一定范围(20 一 35 个核苷酸)内与 Ln 呈直线(G 十 C)十(A 十 T)
最适复性温度为 Tp or-2—5℃。 该法估算的最适复性温度较上法高些。Tp 值较引物模板的 Tss 倪高 5-10℃,这是因为引物复 性后,DNA 聚合酶很快发生聚合反应,在引物 3„端加上数个碱基使引物—模板更稳定,易于在较高 温度下发生廷伸。 研究表明,引物的复性是受动力学因素控制的,而不是受热力学参数控制的。它取决于引物解 离与延伸效率间的平衡。Tp 不仅是 PcR 的最适复性温度,也是 PcR 最佳特异性温度,在等位基因 特异 PCR(As—PCR)时,决定 Tp 很重要。 Tp 值基本上不受 Mg2浓度影响, 当 Mg2由 15mmol/L 升至 10mmol/L 时, Tp 才升高 3℃。 确定了复性温度后,复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。复性时 间也不能太短(>30s)。如用手控温度反应,从复性状态移至延伸状态的时间不能太长,耽搁过长会 增加非特异复性。 (三) 延伸温度与时间
引物延伸温度一般为 72℃(较复性温度高 10℃左右)。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物 的特异性,也会影响其产量。72℃时,核苷酸的掺人率为 35—100 个核苷酸/s,这取决于缓冲体 系、pH、盐浓度和 DNA 模板的性质。72℃延伸 1min 对于长达 2kb 的扩增片段是足够的。然而, 延伸时间决定于靶序列的长度与浓度。3—4kb 的靶序列需 3—4min 延伸,延伸时间过长会导致非 特异扩增带的出现。
PCR 中前几个循环延伸时间应足够长以使靶序列延伸完全,对很低浓度底物的扩增,延伸时间要长 些。 (四) 循环数 循坏数决定着扩增程度。在其它参数都已优化条件下,最适循环数取决于靶序列的初始浓度。 过多的循环会增加非特异扩增产物的数量和复杂性(见平台效应)。当然,循环数太少,PCR 产物就 会极低。在初始靶序列为 3x105,1.5x104,1x103 和 50 拷贝分子时.其循环数可分别为 25—30, 30 一 35,35—40 和 40 一 45 个循环。 除循环数外,扩增效率也是决定扩增程度的重要因素。实验表明,以染色体 DNA 为模板时, 第 25—30 个循环过程中,扩增 DNA 量明显增加。扩增程度(Y)、起始 DNA 量(A)、扩增效率(R)和 循环 数(n)间的关系为: Y=A(1 十 R)n (8) 效率为 100%时,25 个循环后,Y=225.A=33554432A,而效率 R=90%,n=25 时, Y=1.925=9307649A,扩增产物减少 72%,由此可见扩增效率对扩增程度的影 八、其它因素 〔一) 高温起动〔hot start) 由于 Taq DNA 聚合酶在低温下仍具有活性。 因此在一般 PcR 反应的开始加热变性 DNA 后再加 酶的过程中, 引物可与模板发生非特异复性, 这些非特异复性在达到 72℃前就由 Taq 聚合酶在其 3‟ 端聚合上几个碱基并稳定了这种非特异复性引物。因此,可出现非特异延伸和扩增。采用高温起动 法便可克服这一缺点,即使 Taq 聚合酶仅在反应达到较高温度(大于 70℃)时才发挥作用。这可通 过在高温(70℃)下加入某些必需因子(DNA 聚合酶,模板 DNA,Mg2或引物等)来控制。这种方法 不仅可增加 PcR 的特异性,还能增加其敏感性,并可减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。这 是因为在扩增前加热可促进引物的特异复性与延伸,因此增加了有效引物的长度。 (二) PCR 促进刑 1.二甲基亚风(DMSO):许多耐热 DNA 聚合酶厂家推荐在 PCR 反应中加入 10%DMSO,这可 能是 DMSO 有变性 DNA 的作用。DMSO 的使用对大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段是有益的, 但对 Taq DNA 聚合酶有抑制作用, 一般反应中应尽量不用 DMSO。不过,在复合 PCR 中可以用。 2.甘油:有报道,反应中加入 5%一 20%寸油有助于 PCR 反应的复性过程,尤其对 G 十 C 含量高和二级结构多的靶序列以及扩 增长片段(大于 l 500bp)更适用。应注意的是,DMSO 和甘油并非对所有 PCR 均有益,因此,是否 加这些试剂应根据具体情况而定,也需要操作者的探索。 3.氯化四甲基铵(TMAC): 在反应中加入 1x10-4 一 1x10-5mol/L 的 TMAC 可促进 PcR,去 除非特异扩增,而不抑制 Taq 聚合酶。 4.T4 噬菌体基因 32 蛋白质(gp32) :加入 0.5—1ul 的 gp32(1nmol/L,Pharmacia)可使 Taq 聚合酶对长片段 DNA 的扩增改善至少 10 倍。 (三) 石蜡油
反应中所用石蜡油质量要高,不能含抑制 Taq DNA 聚合酶活性的杂质。加石蜡油目的是防止 反应液蒸发后引起的冷却与反应成分的改变。石蜡油的有无对反应影响较大(表 2—2)。但现在 PE—Cetus 公司又研制了一种新型 PCR 仪—9600 型基因扩增 PCR 系统免除了加石蜡油的步骤。 石蜡油对 PcR 产物的影响 石蜡油 产物(Hg) 2013 405 cv 6% 72%
扩增条件:100uI, 94℃,1min; 37℃, 2min,72℃min, 3min 九、PCR 仪 由第一台 PCR 仪问世以来,已有不同加热—冷却机理的 PcR 仪相继诞生。不同仪器由于温控 精度不同对 PCR 反应有一定影响,阅此,优化 PcR 反应时要注意不同仪器间的差别。 十、平台效应(plateau effect) “平台效应”是描述 PCR 后期循环产物对数积累的趋于饱和,并伴随 0.3—1pmol 靶序列的累积。根 据反应条件和热循环,下列因素可能与平台效应有关:①dNTP 和引物快速掺入底物中,浓度降低; ②随产物增加,酶与模板的比例下降;②由于变性温度高(93—95℃)和温度循环,酶活力和 dNTP 的稳定性逐渐下降;④非特异产物或引物二聚体与反应物的竞争;⑤产物在高浓度时变性不完全, 影响引物的延伸;⑧产物浓度高于 10-8mol/L 时,可能降低 Taq 聚合酶的延伸与加工能力 (processivity)或引起产物链的分支迁移和引物转换;⑦酶与 PCR 产物的结合,使酶分子减少。 十一、忠实性 反应中 dNTP 浓度明显低于 Km 值(小于 1umol/L)或某一 dNTP 的浓度低于其它三种的浓度时 会增加错误掺入。 因此, PcR 反应中应使用较高浓度的 dNTP, 且四种 dNTP 浓度一样。 由于 Taq DNA 聚合酶缺乏 3‟→5‟ 外切酶活性,因此,不能象 K1enow 聚合酶那样校正错误掺入的碱基,错误掺人 有利于链的终止,这是因为酶对错误终端的延伸主要依赖于 Km 值的差别。研究表明,酶对 A—T 配对的延伸速率分别比 G—T,C—T 和 T—T 错误快 200,1400 和 2500 倍。这种链终止限制了缺陷 分子的扩增,而有助于保持反应的忠实性。当 dNTP 浓度过高(大于 1mmol/L)时,会促进错配碱基 的延伸。在每种 dNTP 浓度为 10 一 50umol/L 时,高温复性与延伸会最大程度地保持反应的忠实 性。 (from:
1. RNA 提取和逆转录时所用器具均应在 1‰DECP 水中避光浸泡过夜,再高压烘 干 2. DECP 水配制(先加 DEPC,再加水,避光过夜,然后高压) 3. 75%无水乙醇配制(DEPC 水:无水乙醇=1:3)
1. 引物先离心,后用 DEPC 水或双蒸水稀释成 10 倍母液 2. 再取 5ul 母液,加 45ulDEPC 水或双蒸水稀释 10 倍成操作液 凝胶电泳
高效液相色谱仪操作步骤: 1). 过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2). 对抽滤后的流动相进行超声脱气 10-20 分钟。 3). 打开 HPLC 工作站(包括计算机软件和色谱仪) ,连接好流动相管道,连接检测系统。 4). 进入 HPLC 控制界面主菜单,点击 manual,进入手动菜单。 5). 有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵 的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在 manual 菜单下,先点击 purge,再点击 start, 冲洗时速度不要超过 10 ml/min。 6). 调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不 要超过 2000。点击 injure,选用合适的流速,点击 on,走基线). 设计走样方法。点击 file,选取 select users and methods,可以选取现有的各种走样方 法。若需建立一个新的方法,点击 new method。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测 器等,根据需要而不同。选完后,点击 protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前 的稳流,一般 2-5 分钟;b.基线归零;c.进样阀的 loading-inject 转换;d.走样时间,随不同 的样品而不同。 8). 进样和进样后操作。选定走样方法,点击 start。进样,所有的样品均需过滤。方法走 完后,点击 postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基 线). 关机时,先关计算机,再关液相色谱。 10). 填写登记本,由负责人签字。 注意事项: 1). 流动相均需色谱纯度,水用 20M 的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起 气泡。 2). 柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。 3). 所有过柱子的液体均需严格的过滤。 4). 压力不能太大,最好不要超过 2000 psi。 液相色谱法简介 作者: dujinx 正文 气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果, 而必须由已知标准作对照定性。 当 无纯物质对照时,定性鉴定就很困难,这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数 金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。 在经典液相色谱的基础上,引入了气相色谱的理论与技术,在 70 年代初建立了高效液 相色谱分析法(以 HPLC 表示) 。在常压下操作的液相色谱,分离一个样品往往长达几小时 至几十小时, 因此工作效率很低。 人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压 的办法来提高流速,以缩短分离时间,但是结果失败了。根据液相色谱理论,因为随着载液 (流动相)流速的提高,板高则增大,所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高,人们制 成了细小(10μm)而高效的填充物,从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小,
柱压降显着增大, 为了得到合理的载液流速, 使用了高压; 输液泵, 使流速达到 1~10mL/min。 从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。 随着高效固定相、 高压泵和高灵敏 度检测器以及电子技术和计算机技术的应用,70 年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、 高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱,以区别于经 典液相色谱。 高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。 按固定相的聚集状态不同分为液固色谱 法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四 类。 高效液相色谱所用基本概念:保留值等色谱分析有关术语,以及分配系数、分配比、塔 板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致;高效液相色谱所用基本理论:塔板理 论与速率理论也与气相色谱一致。 因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相, 则速 率议程 H=AB/μCμ。式中:纵向扩散项(分子扩散项)B/μ对板高的影响与气相色谱不 同,由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数 Dm 仅为气相色谱中的万分之一,因此 纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项 Cu。由图 14—可知,气相色谱(GC)的流动相流速 u 增大时,板高 H 显着增大(即柱效显着降低) , 而液相色谱(LC)的流速增大时,板高增大不显着(即柱效降低不显着) 。这说明高效液相 色 谱也有很高的分离效能,此外,气相色谱的载气权数种,其性质差别也不大,对分离效 果影响也不大。而液相色谱的载液种类多,性质差别也大,对分离效果影响显着。因此流动 相的选择很重要,并且在选择流动相对应注意以下几点:流动相对样品有适当的溶解度,但 不与样品发生化学反应,也不与固定液互溶;流动相的纯度要高(至少分析纯) 、粘度要小, 以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降; 流动相应与所用检测器相匹配, 不应对组分 检测产生干扰作用。 高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点,还由于它的流动相(载液)种类 比气相色谱的流动相(载气)多,因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相,从机时 可提高选择性。此外,液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定 化合物结构提供纯样品。 由于高效液相色谱法具有以上特点,它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大 (大于 400)的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物,而这些物质占化合 物总数的 75~80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类 化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐 类的分离和分析。 但是,高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面,目前 还不如气相色谱法。 此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法, 因此高效 液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短,相辅相成。 1.分离原理 凝胶色谱,又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同,其阻 滞作用也不同而进行分离、分析的方法。 凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同, 它类似于分子筛的作用, 但凝胶的孔径要比分 子筛大得多,一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色 谱柱后,不同大小的样品分子(图 14—2 中以黑点表示)随流动相沿凝胶颗粒(图 14—2 中以空心圈表示) 外部间隙和凝胶孔穴旁流过, 体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得 到排阻, 因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。 中等体积的分子产生部分 渗透作用, 小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞, 因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲
洗出来。这样,试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱,从而实现分离 目的。 光凝胶色谱采用水溶液作流动相进,称为过滤凝胶色谱(HFC) ,而用有机溶剂为流动相时, 称为凝胶渗透色谱(GPC) 。 2.固定相 凝胶色谱的固定相凝胶,是含有大量液体(一般是水)的柔软而富于弹性的物质,是一 种经过交联而具有立柱网状结构的多聚体。 根据凝胶的交联程度和含水量的不同,分了软质、半硬质和硬质三种。软质凝胶(如葡 聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等)交联度低,膨胀度大,容量大,可压宿,不能用于高压(使用压 力低于 3.5kg/㎝ 2 或更低) ,主要用于含水体系的常压凝胶色谱,半硬质凝胶(如苯乙烯一 二乙烯基苯交联共聚凝胶) ,容量中等,渗透性较高,压力可用到 70kg/㎝ 2。适用于非水溶 剂流动相;硬质凝胶(如多孔硅胶、多也玻球等) ,膨胀度小,不可压缩,渗透性好,可耐 高压,适于高流速下操作。 3.流动相 在凝胶色谱中,为提高分率效率,多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常 用的流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1,2 一二氯乙烷、氯仿、水等。 岛津液相色谱仪注意事项 作者: 孔桂昌 正文 1. 流动相必须用 HPLC 级的试剂,使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质 ( 使用 0.45um 或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气,脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相,这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时,做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时,然 后用甲醇(或 甲醇水溶液)冲洗 40 分钟以上,以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部,做完样品后也必须用 去离子水冲洗 20ml 以上。 5.长时间不用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存,注意不能用纯水保存柱子,而应该用 有机相(如甲醇等),因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18 柱绝对不能进蛋白样品,血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大,按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清 洗方法; ①以异丙醇作溶剂冲洗: ②放在异丙醇中间用超声波清 洗; ⑧用 10%稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳,重现性差,所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时,要使用注射器吸液:通常在输液前要进行流动相 的清洗。 11.要注意柱子的 PH 值范围,不得注射强酸强碱的样品,特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗,然后插入新的 流动相中。 更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 以上是我参考了相关资料, 并结合在安装使用液相色谱仪中的经验得出的, 可能存在某些片 面性,如有不当之处请多提宝贵建议。 岛津 LC_10ATvp 液相色谱仪的故障现象及处理措施
主要原因 1。泵头内进入气泡。 2 。泵头内存有以前的流 动相。 3 .吸滤器的管内进入气 泡。
措 施 ●按 pump ,驱出气泡。 ●排液管连接口连接注射器抽出气泡。 ●按 pump ,将旧流动相完全清洗出去 ●按 pump ,将旧流动相完全清洗出去。 ●震动吸滤器,驱出气泡。 ●吸滤器网眼堵塞时,用超声滤清洗。超声滤 清洗无效时,需更换。(检查吸滤器网眼堵塞的 方法 取出过滤部分,记录压力波形。 如果取 出后压力波形不正常,则吸滤器网眼堵塞。 ) ●对流动相脱气。 ●输送异丙醇,清洗单向阀。 ●清洗无效时,用超声波清洗单向阀,或更换 单向阀. ●更换柱塞密封圈。 ●更换柱塞密封圈后仍漏液时,更换柱塞。 ●用力拧紧公螺母。 ●拧紧后仍漏液时,更换公螺母和箍环。 ●管道过滤器用超声波清洗,或更换过滤器。 ●找出堵塞的部件,更换新部件。 ●更换柱塞。 ●输送异丙醇,清洗单向阀 ●清洗后仍无效时,用超声波清洗单向阀,或 更换单向阀。 ●用超声波清洗吸滤器。超声波清洗无效时, 更换吸滤器。 ●清洗仍无效时,更换单向阀,或用超声波清 洗。 ●用辅助功能ZER。 ADJ,调整零点 ●用超声波清洗管道过滤器,或更换管道过滤 器。 ●找出堵塞的部件,更换部件
5 .泵头与泵头座之间的 缝隙,或清洗液出口漏液 6.流路的连接处漏液 7 .流路堵塞,或将要堵 塞。 8 。柱塞密封圈的使用寿 命将到极限 流量比设定值 小 1.单向阀工作不正常。
2.吸滤器网眼堵塞。(*2) 保留时间的再 现性不良 高压梯度时 2 台输液泵的压 力表示不一致 ( 相 差 在 ± 0 . 5MPa(5kSf / cm2) 或 ± 2%以内属于 正常) 压力上不去 1.单向阀工作不正常。
1 .压力传感器的零点未 对准。 2。其中 1 台输液泵的管 道过滤器网眼堵塞。 3。 2 台输液泵的流路合流 之前,流路有堵塞的地方
●关闭排液阀。 ●拧紧公螺母 ●拧紧后仍无效时,更换公螺母和箍环 ●管道过滤器用超声波清洗,或更换 ●找出堵塞的部件,更换。
气相色谱操作规程及注意事项: 1.气相色谱仪简单操作流程 1.1 反时针方向开启载气钢瓶阀门,减压阀上高压压力表指示出高压钢瓶内贮气压力。 1.2.顺时针方向旋转减压调节螺杆,使低压压力表指示到要求的压力数。 1.3 开启主机电源总开关,主机的触摸式荧光屏显示仪器正在自检,柱室内鼓风马达运转。 1.4 打开与气相色谱仪连接的电脑, 并运行气相色谱仪工作软件, 待软件与仪器连接成功后, 即可进行实验。 1.5 在气相色谱仪工作软件里分别设定载气流量、检测器温度、进样口的温度,柱箱的初始 温度及升温程序等。 设定完后, 各区温度开始朝设定值上升, 当温度达到设定值时, READY 灯亮。 1.6 查看仪器基线是否平稳,待基线平直后,即可进样测试。 1.7 实验完毕后,先关闭检测器电源,再停止加热,待色谱柱、进样口的温度降至 80℃以下 时,依次关闭色谱仪电源开关,计算机电源,最后关闭载气减压阀及总阀。 1.8 登记仪器使用情况,做好实验室的整理和清洁工作,并检查好安全后,方可离开 2 测试条件的设定: 色谱条件的设定要根据不同化合物的不同性质选择柱子,一般情况 极性化合物选择极性柱。 非极性化合物选择非极性柱。 色谱柱柱温的确定主要由样品的复杂 程度决定。 对于混合物一般采用程序升温法。 柱温的设定要同时兼顾高低沸点或溶点化合物. 可根据不同的化合物任意改动, 其目的要达到在最短的时间里, 使每个化合物的组份完全分 离。 3 注意事项: 3.1 操作过程中,一定要先通载气再加热,以防损坏检测器。 3.2 在使用微量进样器取样时 要注意不可将进样器的针芯完全拔出,以防坏进样器。 3.3 检测器温度不能低于进样口温 度, 否则会污染检测器 进样口温度应高于柱温的最高值, 同时化合物在此温度下不分解 3.4 含酸、碱、盐、水、金属离子的化合物不能分析,要经过处理方可进行。 3.5 进样器所取样 品要避免带有气泡以保证进样重现性。 3.6 取样前用溶剂反复洗针,再用要分析的样品至 少洗 2-5 次。
最新气相色谱仪使用方法 1.对色谱仪分析室的要求 (1)分析室周围不得有强磁场,易燃及强腐蚀性气体。 (2)室内环境温度应在 5~35 度范围内,湿度小于等于 85%(相对湿度),且室内应保持空 气流通。有条件的厂最好安装空调。 (3)准备好能承受整套仪器,宽高适中,便于操作的工作平台。一般工厂以水泥平台较 佳(高 0.6~0.8 米),平台不能紧靠墙,应离墙 0.5~1.0 米,便于接线)供仪器使用的动力线KVA 左右,而且仪器使用电源应尽可能不与大功 率耗电量设备或经常大幅度变化的用电设备公用一条线。 电源必须接地良好, 一般在潮湿地 面(或食盐溶液灌注)钉入长约 0.5~1.0 米的铁棒(丝),然后将电源接地点与之相连,总之要求 接地电阻小于 1 欧姆即可。(注:建议电源和外壳都接地,这样效果更好)。 2.气源准备及净化 (1)气源准备事先准备好需用气体的高压钢瓶(一般大中城市均可购到), 庄某一种气体的 钢瓶只能装这种气体,每个钢瓶的颜色代表一种气体,不能互换。一般用氮气,氢气,空气 这三种气体,每种气体最好准备两个钢瓶,以备用。有的厂使用氢气发生器和空气压缩机也 可,但空压机必须无油。凡钢瓶气压下降到 1~2Mpa 时,应更换气瓶。一般厂家使用使用以 上气体 99.99%即可,电子捕获检测器必须使用高纯气源 99.999%以上。 (2)气源净化为了出去各种气体中可能含有的水分,灰分和有机气体成分,在气体进入 仪器之前应先经过严格净化处理。若全部使用钢瓶气体,有的色谱仪附有净化器,且内已填 有 5A 分子筛,活性炭,硅胶,基本可满足要求。若使用一般氢气发生器,则必须加强对水 分的净化处理,故应增大干燥管面积(体积在 450 立方厘米以上为好,填料用 5A 分子筛为 佳),并在发生器后接容积较大的储器桶,以减少或克服气源压力波动时对仪器基线的影响。 若使用空压机作空气来源,空压机进气口应加强空气过滤,加大净化管体积,在干燥管内应 填充一半 5A 分子筛,一半活性炭。一般国产无油气体压缩机可满足需要。 3.色谱仪成套性检查及安放 仪器开箱后, 按资料袋内附件清单, 进行逐项清点, 并将易损零件的备件予以妥善保存。 然后按照仪器的使用说明书上要求,将其放置于工作平台上,并对着接线图和各插头,插座 将仪器各部分连接起来,最后连接记录仪和数据处理机。注意各接头不要接错。
4.外气路的连接 (1)减压阀的安装 有的仪器随机带有减压阀,若没有的则要购买。所用的是 2 只氧气,1 只氢气减压阀。 将 2 只氧气减压阀,1 只氢气减压阀分别装到氮气,空气和氢气钢瓶上(注意氢气减压阀螺 纹是反向的,并在接口处加上所附的 O 形塑料垫圈,以便密封),旋紧螺帽后,关闭减压阀 调节手柄(即旋松),打开钢瓶高压阀,此时减压阀高压表应有指示,关闭高压阀后,其指示 压力不应下降,否则有漏,应及时排除(用垫圈或生料带密封),有时高压阀也会漏,要注意。 然后旋动调节手柄将余气排掉。 (2)外气路连接法把钢瓶中的气体引入色谱仪中,有的采用不锈钢管 (φ 2×0.5mm),有 的采用耐压塑料管(φ 3×0.5mm)。 采用塑料管容易操作, 所以一般采用塑料管。 若用塑料管, 在接头处就要有不锈钢衬管(φ 2×20mm)和一些密封用的塑料等材料。从钢瓶到仪器的塑料 管的长度视需要而定,不宜过长,然后用塑料管把气源和仪器(气体进口)连接起来。 (3)外气路的检漏把主机气路面板上载气,氢气,空气的阀旋钮关闭,然后开启各路钢 瓶 的 高 压 阀 , 调 节 减 压 阀 上 低 压 表 输 出 压 力 , 使 载 气 , 空 气 压 力 为 0.35~0.6Mpa( 约 3.5~6.0kg/cm3),氢气压力为 0.2~0.35 Mpa。然后关闭高压阀,此时减压阀上低压表指示值不 应下降,如下降,则说明连接气路中有漏,应予排除。 5.色谱仪气路气密性检查 气密性检查是一项十分重要的工作, 若气路有漏, 不仅直接导致仪器工作不稳定或灵敏 度下降,而且还有发生爆炸的危险,故在操作使用前必须进行这项工作(气密检查一般是检 查载气流路,氢气和空气流路若未拆动过,可不检查)。 方法是,打开色谱柱箱盖,把柱子从检测器上拆下,将柱口堵死,然后开启载气流路, 调低压输出压力为 0.35~0.6Mpa,打开主机面板上的载气旋钮,此时压力表应有指示。最后 将载气旋钮关闭,半小时内其柱前压力指示值不应有下降,若有下降则有漏,应予排除。若 是主机内气路有漏,则拆下主机有关侧板,用肥皂水(最好是十二烷基磺酸钠溶液)逐个接头 检漏(氢,空气也可如此检漏),最后将肥皂水擦干。 二、 仪器的调试把气路, 仪器等按上述接好, 安置好后, 便可进行下面检查和调试工作。 1.色谱仪电路各部件检查仪器启动前应首先接通载气流路, 调节主机面板上的载气旋钮 (即:载气稳流阀),使载气流量为 20~30ml/min。 (1)启动主机开启主机总电源开关,色谱柱箱内马达开始工作,并检查是否有异样声响, 若有,立即切断电源,并进一步检查排除。有的色谱仪启动时自诊断,显示仪器运转情况: 正常或不正常,不正常显示包括哪一部分有问题,接线)各路温控检查按照说明书,逐个对柱温(包括程序升温),进样器温度,检测器温度进
行恒温检查,是否能在高,中,低温度下保持恒定,特别是要求柱温温控精度达到 0.01 度。 气相色谱安装调试注意事项及方法 发布日期: 一、色谱仪的安装 1.对色谱仪分析室的要求 (1)分析室周围不得有强磁场,易燃及强腐蚀性气体。 (2)室内环境温度应在 5~35 度范围内,湿度小于等于 85%(相对湿度),且室内应保持空 气流通。有条件的厂最好安装空调。 (3)准备好能承受整套仪器,宽高适中,便于操作的工作平台。一般工厂以水泥平台较 佳(高 0.6~0.8 米),平台不能紧靠墙,应离墙 0.5~1.0 米,便于接线)供仪器使用的动力线KVA 左右,而且仪器使用电源应尽可能不与大功 率耗电量设备或经常大幅度变化的用电设备公用一条线。 电源必须接地良好, 一般在潮湿地 面(或食盐溶液灌注)钉入长约 0.5~1.0 米的铁棒(丝),然后将电源接地点与之相连,总之要求 接地电阻小于 1 欧姆即可。(注:建议电源和外壳都接地,这样效果更好)。 2.气源准备及净化 (1)气源准备 事先准备好需用气体的高压钢瓶(一般大中城市均可购到),庄某一种气体的钢瓶只能装 这种气体, 每个钢瓶的颜色代表一种气体,不能互换。一般用氮气, 氢气, 空气这三种气体, 每种气体最好准备两个钢瓶,以备用。有的厂使用氢气发生器和空气压缩机也可,但空压机 必须无油。 凡钢瓶气压下降到 1~2Mpa 时, 应更换气瓶。 一般厂家使用使用以上气体 99.99% 即可,电子捕获检测器必须使用高纯气源 99.999%以上。 (2)气源净化 为了出去各种气体中可能含有的水分, 灰分和有机气体成分, 在气体进入仪器之前应先 经过严格净化处理。 若全部使用钢瓶气体, 有的色谱仪附有净化器, 且内已填有 5A 分子筛, 活性炭,硅胶,基本可满足要求。若使用一般氢气发生器,则必须加强对水分的净化处理, 故应增大干燥管面积(体积在 450 立方厘米以上为好,填料用 5A 分子筛为佳),并在发生器后 接容积较大的储器桶, 以减少或克服气源压力波动时对仪器基线的影响。 若使用空压机作空 气来源,空压机进气口应加强空气过滤,加大净化管体积,在干燥管内应填充一半 5A 分子 筛,一半活性炭。一般国产无油气体压缩机(天津产)可满足需要。 3.色谱仪成套性检查及安放
仪器开箱后, 按资料袋内附件清单, 进行逐项清点, 并将易损零件的备件予以妥善保存。 然后按照仪器的使用说明书上要求,将其放置于工作平台上,并对着接线图和各插头,插座 将仪器各部分连接起来,最后连接记录仪和数据处理机。注意各接头不要接错。 4.外气路的连接 (1)减压阀的安装 有的仪器随机带有减压阀,若没有的则要购买。所用的是 2 只氧气,1 只氢气减压阀。 将 2 只氧气减压阀,1 只氢气减压阀分别装到氮气,空气和氢气钢瓶上(注意氢气减压阀螺 纹是反向的,并在接口处加上所附的 O 形塑料垫圈,以便密封),旋紧螺帽后,关闭减压阀 调节手柄(即旋松),打开钢瓶高压阀,此时减压阀高压表应有指示,关闭高压阀后,其指示 压力不应下降,否则有漏,应及时排除(用垫圈或生料带密封),有时高压阀也会漏,要注意。 然后旋动调节手柄将余气排掉。 (2)外气路连接法 把钢瓶中的气体引入色谱仪中, 有的采用不锈钢管(φ 2×0.5mm), 有的采用耐压塑料管 (φ 3×0.5mm)。采用塑料管容易操作,所以一般采用塑料管。若用塑料管,在接头处就要有 不锈钢衬管(φ 2×20mm)和一些密封用的塑料等材料。从钢瓶到仪器的塑料管的长度视需要 而定,不宜过长,然后用塑料管把气源和仪器(气体进口)连接起来。 (3)外气路的检漏 把主机气路面板上载气,氢气,空气的阀旋钮关闭,然后开启各路钢瓶的高压阀,调节 减压阀上低压表输出压力,使载气,空气压力为 0.35~0.6Mpa(约 3.5~6.0kg/cm3),氢气压力为 0.2~0.35 Mpa。然后关闭高压阀,此时减压阀上低压表指示值不应下降,如下降,则说明连 接气路中有漏,应予排除。 5.色谱仪气路气密性检查 气密性检查是一项十分重要的工作, 若气路有漏, 不仅直接导致仪器工作不稳定或灵敏 度下降,而且还有发生爆炸的危险,故在操作使用前必须进行这项工作(气密检查一般是检 查载气流路,氢气和空气流路若未拆动过,可不检查)。 方法是,打开色谱柱箱盖,把柱子从检测器上拆下,将柱口堵死,然后开启载气流路, 调低压输出压力为 0.35~0.6Mpa,打开主机面板上的载气旋钮,此时压力表应有指示。最后 将载气旋钮关闭,半小时内其柱前压力指示值不应有下降,若有下降则有漏,应予排除。若 是主机内气路有漏,则拆下主机有关侧板,用肥皂水(最好是十二烷基磺酸钠溶液)逐个接头 检漏(氢,空气也可如此检漏),最后将肥皂水擦干。